四環(huán)素
快速檢測試劑盒說明書
一、原理
本試劑盒采用間接競爭ELISA方法，在微孔條上預(yù)包被偶聯(lián)抗原，樣本中的殘留物四環(huán)素將和微孔條上預(yù)包被的偶聯(lián)抗原競爭抗四環(huán)素抗體，加入酶標(biāo)記物后，用TMB底物顯色，樣本吸光值與其所含殘留物四環(huán)素的含量成負相關(guān)，與標(biāo)準曲線比較即可得出相應(yīng)殘留物四環(huán)素的含量。
二、試劑盒特性
u 試劑盒靈敏度： 0.5ppb
u 孵育溫度： 25℃
u 孵育時間： 30min～15min
u 樣本檢測下限
豬肉、豬肝、雞肉樣本：
四環(huán)素 10ppb
二甲an四環(huán)素 15ppb
吡四環(huán)素 15ppb
金霉素 20ppb
脫甲基金霉素 25ppb
土霉素 35ppb
強力霉素 40ppb
u 交叉反應(yīng)率
四環(huán)素 100%
二甲an四環(huán)素 85%
吡四環(huán)素 70%
金霉素 50%
脫甲基金霉素 42%
土霉素 30%
強力霉素 25%
u 樣本回收率
雞肉、豬肉、豬肝 70%-120%
三、試劑盒組成
1 | 微量測試孔 | 每條8孔，一板12條 | ||
2 | 20X標(biāo)準品（810ppb） | 1ml | 黑色帽 | |
3 | 高濃度標(biāo)準品（1ppm） | 1ml | 黑色帽 | |
4 | 酶標(biāo)記物 | 7ml | 白色帽 | |
5 | 抗體工作液 | 7ml | 白色帽 | |
6 | 底物A液 | 7ml | 白色帽 | |
7 | 底物B液 | 7ml | 黑色帽 | |
8 | 終止液 | 7ml | 黃色帽 | |
9 | 20X濃縮洗滌液 | 15ml | 白色帽 | |
10 | 20X濃縮提取液 | 50ml | 透明帽 | |
11 | 標(biāo)準品復(fù)溶液 | 15ml*2 | 藍色帽 | |
四、所用儀器、試劑
具備的儀器：酶標(biāo)儀、均質(zhì)器、振蕩器、離心機、刻度移液管、天平（感量0.01g）、恒溫箱
微量移液器：單道 20～200µl、單道100～1000µl、多道 30～300 µl
試 劑：濃鹽酸、氫氧化鈉
五、樣本前處理步驟
u 樣本處理前須知
（a）實驗中必須使用一次性吸頭，吸取不同試劑時要更換吸頭。
（b）實驗之前須檢查各種實驗器具是否干凈，必要時可對實驗器具進行清潔，以避免污染干擾實驗結(jié)果。
u 樣本前處理需配制：
配液 1：0.2M 鹽酸
取 17.2ml 濃鹽酸加去離子水定容至 1L
配液 2：1 M 氫氧化鈉
稱 4g 氫氧化鈉固體加去離子水定容至100ml
配液 3 樣本提取液
將20X 濃縮提取液與去離子水 1:19 稀釋后用
u 組織樣本的處理方法
1、稱 2±0.05g 均質(zhì)后的組織至50ml離心管中，加入3ml 0.2M鹽酸（見配液1），充分振蕩3min；
2、再加入600µl 1M 氫氧化鈉（見配液2）溶液和2.4ml樣本提取液（見配液3）溶液，充分振蕩3min，室溫4000r/min 以上離心 5min；
3、取50µl上層液進行分析。
樣本稀釋倍數(shù)：4
六、 酶標(biāo)免疫分析程序:
u 測定前應(yīng)須知：
1、使用前將需用試劑和板條的溫度回升至室溫（20～25℃）。
2、使用之后立即將所有試劑放回2～8℃。
3、在ELISA分析中的再現(xiàn)性，很大程度上取決于洗板的一致性，正確的洗板操作是ELISA測定程序中的要點。
4、所有恒溫孵育過程，避免光線照射，用蓋板膜蓋住微孔板。
u 操作步驟：
1、 從2～8℃冷藏環(huán)境中取出所需試劑，室溫（20～25℃）平衡30min以上，注意每種液體試劑使用前均須搖勻。
2、 配制標(biāo)準品
標(biāo)準品6（40.5ppb）：
50µl 20X標(biāo)準品（810ppb）用 950µl 標(biāo)準品復(fù)溶液稀釋；
標(biāo)準品5（13.5ppb）：
600µl 標(biāo)準品復(fù)溶液與 300µl 標(biāo)準品 6 混合；
標(biāo)準品4（4.5ppb）：
600µl 標(biāo)準品復(fù)溶液與 300µl 標(biāo)準品 5 混合；
標(biāo)準品3（1.5ppb）：
600µl 標(biāo)準品復(fù)溶液與 300µl 標(biāo)準品 4 混合；
標(biāo)準品2（0.5ppb）：
600µl 標(biāo)準品復(fù)溶液與 300µl 標(biāo)準品 3 混合；
標(biāo)準品1（0ppb）：
直接使用標(biāo)準品復(fù)溶液
2、 取出框架及需要數(shù)量的微孔，將不用的微孔放入自封袋，保存于2-8℃。
3、 配液：將15ml濃縮洗滌液（20倍濃縮）用去離子水按照1：19稀釋（1份濃縮洗滌液+19份去離子水），或按所需用量配制洗滌液。
4、 編號：將樣本和標(biāo)準品對應(yīng)微孔按序編號，每個樣本和標(biāo)準品做2孔平行，并記錄標(biāo)準孔和樣本孔所在的位置。
5、 加標(biāo)準品/樣本50µl/孔到各自的微孔中，然后加加入酶標(biāo)記物50µl/孔再加入抗體工作液50µl/孔，用蓋板膜封板，輕輕振蕩混勻。25℃環(huán)境中反應(yīng)30min。
6、 將孔內(nèi)液體甩干，用已稀釋的洗滌液250µl/孔洗板4～5次，每次間隔15～30秒，用吸水紙拍干（拍干后未清除的氣泡可用干凈的槍頭刺破）。
7、 顯色：加入底物A液50µl/孔，再加入底物B液50µl/孔，輕輕振蕩混勻，25℃環(huán)境中避光顯色15min。
8、 測定：加入終止液50µl/孔，輕輕振蕩混勻，設(shè)定酶標(biāo)儀于450nm處（建議用雙波長450/630nm檢測，5min內(nèi)讀數(shù)），測定每孔OD值。
七、結(jié)果判定
結(jié)果判定有兩種方法，粗略判定可用第1種方法，定量判定用第2種方法。注意樣本吸光度值與其所含四環(huán)素量成負相關(guān)。
1、粗略判定：
用樣本的平均吸光度值與標(biāo)準值比較即可得出其濃度范圍(ng/ml)。假設(shè)樣本1的吸光度值為0.3，樣本2的吸光度值為1.0，標(biāo)準液吸光度值分別是：0ppb為2.243； 0.5ppb為1.816；1.5ppb為1.415；4.5ppb為0.74；13.5ppb為0.313；40.5ppb為0.155。則樣本1的濃度范圍是13.5ppb～40.5ppb；樣本2的濃度范圍是1.5ppb～4.5ppb，乘以其對應(yīng)的稀釋倍數(shù)即為樣本中四環(huán)素實際濃度。
2、定量分析
（1）百分吸光率的計算，標(biāo)準品或樣本的百分吸光率等于標(biāo)準品或樣本的吸光度值的平均值（雙孔）除以第一個標(biāo)準（0標(biāo)準）的吸光度值，再乘以100%，即
百分吸光率（%）＝ | B | ×100% |
B0 |
B—標(biāo)準溶液或樣本溶液的平均吸光度值
B0—0ng/ml標(biāo)準溶液的平均吸光度值
（2）標(biāo)準曲線的繪制與計算
以標(biāo)準品百分吸光率為縱坐標(biāo)，以四環(huán)素標(biāo)準品濃度（ng/ml）的半對數(shù)為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準曲線圖。將樣本的百分吸光率代入標(biāo)準曲線中，從標(biāo)準曲線上讀出樣本所對應(yīng)的濃度，乘以其對應(yīng)的稀釋倍數(shù)即為樣本中四環(huán)素實際濃度。
若利用試劑盒專業(yè)分析軟件進行計算，更便于大量樣本的準確、快速分析。
八、 注意事項
1、 室溫低于25℃或試劑及標(biāo)本未回到室溫（20～25℃）會導(dǎo)致所有標(biāo)準的OD值偏低。
2、 在洗板過程中如果出現(xiàn)板孔干燥的情況，則會伴隨著標(biāo)準曲線不成線性，重復(fù)性不好的現(xiàn)象。所以洗板拍干后應(yīng)立即進行下一步操作。
3、 混合要均勻，否則會出現(xiàn)重復(fù)性不好的現(xiàn)象。
4、 反應(yīng)終止液為2M硫酸，避免接觸皮膚。
5、 不要使用過了有效日期的試劑盒；稀釋或攙雜使用會引起靈敏度、OD值變化；不要交換使用不同批號的盒中試劑。
6、 不用的微孔板放進自封袋重新密封；標(biāo)準物質(zhì)和無色的發(fā)色劑對光敏感，因此要避免直接暴露在光線下。
7、 顯色液若有任何顏色表明變質(zhì)，應(yīng)當(dāng)棄之。標(biāo)準品1的吸光度值小于0.5時，表示試劑可能變質(zhì)。
8、 該試劑盒zui佳反應(yīng)溫度為25℃，溫度過高或過低將導(dǎo)致檢測吸光度值和靈敏度發(fā)生變化。
九、儲藏條件和保質(zhì)期
1、 儲藏條件：試劑盒于2-8℃保存，不要冷凍。
2、 保 質(zhì) 期：該產(chǎn)品有效期為1年，生產(chǎn)日期見包裝盒。
提示：酶標(biāo)板真空包裝袋若有漏氣，酶標(biāo)板仍然正常有效，不影響實驗結(jié)果，請放心使用。
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